荧光定量PCR检测HBV—DNA与乙肝两对半检测结果的相关性探讨

中外医学研究　≯　曩薯　曩ｌｌ｜。Ｉ曩　毒　２０１０年８月第８卷第１８期　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＡＮＤ　ＦＯＲＥＩＧＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　｜。　。｜≯囊ｌ：曩｜　。　｜囊≯誊｜≯＿　．＝≯譬　毒｜　：－｜曩　者　荧光定量ＰＣＲ检测ＨＢＶ—ＤＮＡ与乙肝两对半　检测结果的相关性探讨　欧阳琳刘小华　刘先林　兴国县人民医院检验科（江西　兴国３４２４００）　【摘要】　目的探讨ＨＢＶ—ＤＮＡ的检出情况与乙肝两对半结果之间的关系。方法运用荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ—ＰＣＲ）检测６２３例　ＨＢｓＡｇ（＋）　疑似乙肝患者血清中的ＨＢＶ—ＤＮＡ，同时运用ＥＬＩＳＡ方法进行两对半指标的检测，并对结果进行相关性探讨。结果ＨＢｅＡｇ（＋）ＨＢｃＡｂ（＋）组（大三阳组）患者血清ＨＢＶ—ＤＮＡ检出率为９７．０％（２５５／２６３），平均拷贝数为７．１６Ｅ＋０６　ＩＵ／ｍｌ；ＨＢｓＡｇ（＋）　ＨＢｅＡｂ（＋）ＨＢｃＡｂ（＋）组（小三阳组）患者血清ＨＢＶ—ＤＮＡ检出率为８３．３％（２００／２４０），平均拷贝数为５．２３Ｅ＋０５　ＩＵ／ｍｌ：ＨＢｓＡｇ（＋）　ＨＢｃＡｂ（＋）组血清ＨＢＶ—ＤＮＡ检出率为５３．８％（４３／８０），平均拷贝数为２．８７Ｅ＋（）５　ＩＵ／ｍｌ；ＨＢｓＡｂ（＋）组血清ＨＢＶ—ＤＮＡ检出率为　５０％（１／２），平均拷贝数为１．８３Ｅ＋０３　ＩＵ／ｍｌ；ＨＢｃＡｂ（＋）组血清ＨＢＶ—ＤＮＡ检出率为２０％（１／５），平均拷贝数为３．００Ｅ＋０４　Ｉｕ／ｍｌ；　ＨＢｓＡｂ（＋）ＨＢｅＡｂ（＋）ＨＢｃＡｂ（＋）组血清ＨＢＶ—ＤＮＡ捡出率为４０％（２／５），平均拷贝数为９．２３Ｅ＋０３　Ｉｕ／ｍＩ；ＨＢｓＡｇ（＋）组血清ＨＢＶ　ＤＮＡ检出率为１３．３％（２／１５），平均拷贝数为１．１８Ｅ＋０７　ＩＵ／ｍｌ；ＨＢＶ—Ｍ全阴性组ＨＢＶ—ＤＮＡ检出率为１２．５％（１／８），平均拷贝数　为１．２３Ｅ＋０４　ＩＵ／ｍｌ。结论ＨＢＶ—Ｍ阴性患者仍有ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性者，因此在检测中应联合应用两种方法进行检测，提高检出率，　避免漏诊，为临床ＨＢＶ感染、复制及传染性的判断以及指导治疗提供更为可靠的判定依据。　【关键词】ＨＢＶ—ＤＮＡ；　荧光定量ＰＣＲ；　两对半　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢＶ．ＯＵ　一ｌｉｎ，　Ｘｉａｏ—ｈｕａ，ＬＩＵ　Ｘｉａｎ—ｌｉｎ．Ｔｈｅ　Ｐｅｏｐｌｅ　ｓ　ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ｇｕｏ，　ｇｕｏ　３４２４００，Ｃｈｉｎａ．　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ａｎｄ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢＶ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨＢＶ—　ＤＮＡ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ（ＦＱ—ＰＣＲ）ａｎｄ　ＨＢＶ　ｗａｓ　ｒｏｕｔｉｎｅｌｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥＬＩＳＡ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　６２３ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ｗａｓ　９７．０％（２５５／２６３）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｗａｓ　７．１６Ｅ＋０６　ＩＵ／ｍｌ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ＨＢｓＡｇ（＋），ＨＢｅＡｇ（＋）ａｎｄ　ＨＢｃＡｂ　（＋）（ｇｒｏｕｐ　Ａ），８３．３％（２００／２４０）ａｎｄ　５．２３Ｅ＋０５　ＩＵ／ｍｌ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ＨＢｓＡｇ（＋），ＨＢｅＡｂ（＋）ａｎｄ　ＨＢｃＡｂ（＋）（ｇｒｏｕｐ　Ｂ），５３．８％　（４３／８０）ａｎｄ　２．８７Ｅ十０５　ＩＵ／ｍｌ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ＨＢｓＡｇ（＋）ａｎｄ　ＨＢｃＡｂ（＋）（ｇｒｏｕｐ　Ｃ）；Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；５０％（１／２）ａｎｄ　１．８３Ｅ＋０３　ＩＵ／ｍｌ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ＨＢｓＡｂ（＋），２０％（１／５）ａｎｄ　３．００Ｅ＋０４　ＩＵ／ｍｌ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ＨＢｃＡｂ（＋），４０％（２／５）ａｎｄ　９．２３Ｅ＋０３　ＩＵ／　ｍｌ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ＨＢｓＡｂ（＋），ＨＢｅＡｂ（＋）ａｎｄ　ＨＢｃＡｂ（＋），１３．３％（２／１５）ａｎｄ　１．１８Ｅ＋０７　ＩＵ／ｍｌ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ＨＢｓＡｇ（＋）；１２．５％（１／　８、ａｎｄ　１．２３Ｅ＋０４　ＩＵ／ｍｌ　ｉｎ　ＨＢＶ—Ｍ—ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＨＢＶ—ＤＮＡ　ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｍａｙ　ａｐｐｅａｒ　ｉｎ　ＨＢＶ—Ｍ—ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．　．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅ　２　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｕｓｅ￣ｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｍｏｒｅ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｊｕｄｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ＨＢＶ　ｉｆｅｃｔｎｉｏｎ，ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｒａｃｔｉｃｅ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ＨＢＶ—ＤＮＡ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢＶ　乙型肝炎是世界上最常见的传染病之一，世界卫生组织　（ＷＨＯ）估计，全球慢性乙肝病毒感染多达３．６亿，我国占１．２　亿。本病每年造成１００万人死亡　Ｊ。慢性乙型肝炎是ＨＢＶ感染　的一种严重后果，部分可进展为肝硬化、肝衰竭或原发性肝癌。　ＨＢＶ—ＤＮＡ是直接反映乙肝病毒存在、活动性复制及具有传染　性的可靠指标　ｊ。但目前我国现状ＨＢＶ感染者多以其血清感染　标志物（ＨＢＶ—Ｍ）判定，由于其组合模式复杂多样，从而导致了　标本血清的不同ＨＢＶ血清学标志物组合进行了ＨＢＶ—ＤＮＡ检　测，并对结果进行了统计学处理，以探讨ＨＢＶ—Ｍ与ＨＢＶ～ＤＮＡ　复制水平的关系，现报告如下：　１　资料与方法　１．１一般资料标本来源均系２００９年１月～２００９年５月到笔　者所在院就诊的所有同时做过乙肝两对半及ＨＢＶ—ＤＮＡ检测的　疑似乙肝的门诊和住院患者，共６２３例，其中女２９８人，男３２５　临床上对部分发病患者的ＨＢＶ感染复制状况难以判断，有时甚　人，年龄１７～７８岁，平均３９岁。　至会出现漏诊的情况。定量ＰＣＲ法的应用，使得我们进行　ＨＢＶ—ＤＮＡ的检测的同时得以对其进行相对的量化，这对于乙　肝患者体内的ＨＢＶ的复制以及传染性有更直接的了解，同时也　更有利于对临床ＨＢＶ感染的诊断、治疗方案的选择及疗效的判　断。本文采用荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ—ＰＣＲ）对６２３例疑似乙肝患者　１．２方法检测仪器用Ｌｉｎｅ～Ｇｅｎｅ定量扩增仪（德国），凯特　ＫＣ一１００全自动酶标仪（德国）。检测方法和试剂：（１）ＨＢＶ—Ｍ　检测：用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ法）检测，试剂由维坊三维生　物技术有限公司提供，并严格按说明书操作。（２）ＨＢＶ—ＤＮＡ定　量分析：采用荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ—ＰＣＲ）法检测，试剂由上海复星　１——　中外医学研究　簦鹫费∥　誓嘉　　８期２０１０年８月　第８卷　第１ＣＨＩＮＥＳＥ　ＡＮＤ　ＦＯＲＥＩＧＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　　－一　｜曩　８。－－－｜　｜　算　簪姜曩鸯蔓　参≯露乎毒澎　黪黪　碧　蕾重量　。一　ｔ一｜　曩　≯｜。　委　。｜ｉ　｜　｜示该组中的患者仍具有较强的病毒复制，传染性强，此情况可能　为血清转换期或前Ｃ区突变，如果经过动态观察，仍表现ＨＢｓＡｇ　（＋）ＨＢｃＡｂ（＋）及ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性，可能为前Ｃ区突变　。　医学科技发展有限公司提供，严格按说明书的步骤进行操作。　１．３统计学处理根据ＨＢＶ血清标志物分为８组，将各组的　ＨＢＶ—ＤＮＡ平均拷贝数进行对数变换，以指数表示，定量测量范　围仍用实际检测值表示；采用　检验进行组间ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性　率显著性检验，采用两样本均数的ｔ检验比较拷贝数。　２结果　在２例ＨＢｓＡｂ（＋）血清中，仍检测出１例ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性，　检出率为５０％，平均拷贝数为１．８３Ｅ＋０３　ＩＵ／ｍｌ，５例ＨＢｃＡｂ　（＋）血清中１例检出ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性，检出率为２０％，平均拷　６２３例疑似乙肝患者血清标本　贝数３．ＯＯＥ＋０４　ＩＵ／ｍｌ，说明ＨＢｓＡｂ产生和ＨＢｅＡｇ转阴并不意味　着病毒的复制停止或减弱。有学者认为此现象有可能与ＨＢＶ—　２．１　ＨＢＶ—ＤＮＡ定量测定结果中，５４３例ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性，８Ｏ例阴性，阳性最低拷贝数为　Ｉ．３０Ｅ＋０３　ＩＵ／ｍｌ，最高拷贝数为７．７０Ｅ＋０９　ＩＵ／ｍｌ。　２．２　ＨＢＶ—ＤＮＡ定量测定与ＨＢＶ—Ｍ的关系，见表１。　表１　ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢＶ—Ｍ和荧光定量ＰＣＲ检测　ＨＢＶ—ＤＮＡ结果　３讨论　ＦＱ—ＰＣＲ是进行临床基因诊断的有效手段，它采用了完全　闭管检测，简便快速、重复性好、特异性强、灵敏度高，不需要ＰＣＲ　后处理，避免了交叉感染；同时采用实时检测技术，所得ｃｔ值和　原始模板数量完全呈线形相关，定量准确率极高　Ｊ，它不仅具有　普通ＰＣＲ的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电　传导系统直接探测ＰＣＲ扩增过程中荧光信号的变化以获得定量　结果，所以还具有ＤＮＡ杂交的高特异性和光谱的高精确性，克服　了常规ＰＣＲ的许多缺点Ｈ　Ｊ。　ＥＬＩＳＡ法检测乙肝两对半是临床诊断ＨＢＶ感染的传统手　段，它检测的是人体对ＨＢＶ的免疫反应状态，而ＦＱ—ＰＣＲ则可　以准确的反应出ＨＢＶ—ＤＮＡ的复制水平、病程变化和恢复情况　等。本文结果显示，２６３例大三阳组中，其ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性２５５　例，检出率达９７．０％，而且呈较高的拷贝量，经统计学处理大三　阳组和ＨＢｓＡｇ（＋）ＨＢｃＡｂ（＋）组与小三阳组有显著性差异，说　明这些患者ＨＢＶ具有较高的复制水平，是具有传染性的重要　标志。　２４０例小三阳血清中２００例检出ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性，检出率为　８３．３％，平均拷贝数达到５．２３Ｅ＋０５　ＩＵ／ｍｌ，虽然其拷贝数和阳性　率均低于大三阳组，但仍然具有较强的传染性，说明ＨＢｅＡｂ的存　在并不表示患者体内没有病毒复制，与既往文献报道结果吻合。　在８０例ＨＢｓＡｇ（＋）ＨＢｃＡｂ（＋）血清中，有４３例检出ＨＢＶ—　ＤＮＡ阳性，检出率为５３．８％，平均拷贝数为２．８５Ｅ＋０５　ＩＵ／ｍｌ，提　一８一　ＤＮＡ前Ｃ区发生突变有关，出现“免疫逃逸”或不同亚型的ＨＢＶ　重叠感染　Ｊ。也有学者证明乙型肝炎ＨＢｓＡｂ出现后，血清内仍　有ＤＮＡ复制，随着时间的推移ＨＢＶ—ＤＮＡ的检出率逐渐　下降　。　１５例乙肝两对半全阴性的患者中仍有１例ＨＢＶ—ＤＮＡ阳　性，平均拷贝数为１．２３Ｅ＋０４　ＩＵ／ｍｌ，阳性率为１２．５％，据国内外　文献报道证实ＨＢＶ—ＤＮＡ的出现早于其他血清标志物，因此该ｉ　例受检者可能处于早期感染。乙肝两对半标志物全阴性的患者　不能排除ＨＢＶ感染，但聚合酶链反应灵敏度高，可检测出低浓度　的ＨＢＶ—ＤＮＡ。因此ＰＣＲ的高灵敏度可作为早期诊断ＨＢＶ感　染提供依据，提示在临床上对ＨＢＶ—Ｍ均阴性者，有进一步进行　ＨＢＶ—ＤＮＡ、ＦＱ—ＰＣＲ检测的必要，以确立有无ＨＢＶ感染。　综上所述，本研究结果表明，ＰＣＲ与ＥＬＩＳＡ两种方法检测　ＨＢＶ感染与复制，多种血清学标志物模式都有一定的ＨＢＶ—　ＤＮＡ检出率，由于ＤＮＡ阳性表示ＨＢＶ在体内复制，如果仅以　ＨＢＶ—Ｍ的检测结果作为判断ＨＢＶ—ＤＮＡ感染、传染性以及　ＨＢＶ是否在体内复制有一定的局限性，因此，为临床提供ＨＢＶ　感染、复制及传染性判断以及指导治疗和观察疗效，我们应选择　乙肝两对半标志物并同时做ＨＢＶ—ＤＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检测。　参考文献　［１］Ｄａｖｅｙ　Ｓ．Ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＷｏＡｄ’Ｓ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ．　ｖａ：ＷｏＡｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，１９９６：７６．　［２］彭文伟．病毒性肝炎研究．广州：广东科技出版社，１９９８：３．　［３］程刚，何蕴韶，周新宇．荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎　病毒．中华医学检验杂志，１９９９，２２（３）：１３５．　［４］孙静，陈曲渡，张林林，等．乙肝标志物模式与ＨＢＶ—ＤＮＡ定　量的分析比较．现代中西医结合杂志，２００２，１１（８）：７５０．　［５］Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ＦＦ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｐｒｅｃｏｒｅ　ｍｕｔｎａｔｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ｃｏｒｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，　１９９５，２２：１６４１．　，　［６］陈素玲，胡国龄，谭德明．３８１例ＨＢＶ感染者ＨＢＶ—ＤＮＡ前Ｃ　区基因突变的研究．中国现代医学杂志，２００１，ｌ（８）：４８—５０．　［７］王国义，李雷，陈自平．慢性乙型肝炎病变活动与血清ＨＢＶ—　ＤＮＡ含量的关系．中国现代医学杂志，２００１，１（１０）：１０２．　【收稿ｔ３期】２０１０—０５—２８