葡萄糖酸钠发酵废弃菌丝体提取壳聚糖的研究

．１　５８．２０１６　ＶｏＩ・３５　ＮＯ．１２　ＩＳ　ｅｒｉａＩ　Ｎｏ．２９８　Ｃｈｉｎａ　Ｂｒｅｗｉｎｇ¨口　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅｓ　葡萄糖酸钠发酵废弃菌丝体提取壳聚糖的研究　孙永巧　，张家祥　，刘建军　（１．齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南，２５０３５３；２．山东省食品发酵工业研究设计院，山东济南，２５００１３）　摘要：以产葡萄糖酸钠的废弃菌丝体为原料，探究了从废弃黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）菌丝体提取壳聚糖的工艺条件。对废弃菌丝　体进行了各组分分析后，在单因素的基础上对提取工艺进行优化，得出了碱法提取壳聚糖的最佳优化条件：料液比为ｌ：３０（ｇ：ｍＬ），　６％ＮａＯＨ处理２　ｈ，反应温度为９５℃时，菌体蛋白去除率达￣Ｉ］７７．２６％；碱（ＮａＯＨ）浓度为３０％，处理温度为１２０℃，脱蛋白处理后样品　采用重复碱处理的方式脱乙酰，样品分两次重复用３０％ＮａＯＨ溶液在１２０℃下各处理１　ｈ，得到壳聚糖的脱乙酰度为７８．８５％，壳聚糖　得率为１０．５３％；后续用１２％醋酸纯化处理，得到脱乙酰度为８４．４９％的壳聚糖，得率为９．５６％。　关键词：黑曲霉；壳聚糖；蛋白去除率；脱乙酰度　中图分类号：ＴＱ９２Ｏ．９　文章编号：０２５４—５０７１（２０１６）１２—０１５８—０５　ｄｏｉ：１０．１１８８２／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４—５０７１．２０１６．１２．０３３　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｆｒｏｍ　ｗａｓｔｅｄ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｃｏｎａｔｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ＳＵＮ　Ｙｏｎｇｑｉａｏ　，ＺＨＡＮＧ　Ｊｉａｘｉａｎｇ　，ＬＩＵ　Ｊｉａｎｊｕｎ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＱｉｌｕＩｎｄｕｓｔｉｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ２５０３５３，Ｃｈｉｎａ；　２．ＦｏｏｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＩｎｄｕｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄＤｅｓｉｇｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｊｉｎａｎ２５００１３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ　ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｃｏｎａｔｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ａｓ　ｒａｗ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｆｒｏｍ　ｗａｓｔｅ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ．Ａｆｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｗａｓｔｅ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ，ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ，ｔｈｅ　ｅｘ￣ａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｔｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｌｋａｌｉ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｗｅｒｅ　ｓｏｌｉｄ—ｌｉｑｕｉｄ　ｒａｔｉｏ　１：３０（ｇ：ｒｎ１），６％ＮａＯＨ　ｒｔｅａｔｍｅｎｔ　２　ｈ，ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　９５　ｑＣ，ｆｕｎｇａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ　７７．２６％．Ｓｔｒｏｎｇ　ａｌｋａｌｉ（ＮａＯＨ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　３０％，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　１２０℃，ａｆｔｅｒ　ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ，ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅａｃｙｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ａｌｋａｌｉ　ｒｅａｔｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｈ　ｔ３０％ＮａＯＨ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　１２０　ｏＣ　ｆｏｒ　１　ｈ　ｉｎ　ｔｗｉｃｅ，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｗａｓ　７８．８５％，ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｙｉｅｌｄ　ｗａｓ　１０．５３％．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｗｉｈ　１２％ａｃｅｔｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｔｈｅ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ　ｗａｓ　８４．４９％．ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｙｉｅｌｄ　ｗａｓ　９．５６％．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ，ｃｈｉｔｏｓａｎ；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ；ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　壳聚糖（ｃｈｉｔｏｓａｎ，ＣＴＳ）又称脱乙酰甲壳素或可溶性　甲壳素，化学名称为葡聚糖胺（１．４）．２－氨基．　Ｄ－葡萄糖，　分子式为（Ｃ６Ｈ　ＮＯ４）ｎ，是自然界唯一的动物性碱性多糖。　陈雪梅等【　采用碱处理从柠檬酸厂废弃黑曲霉菌丝　体中提取壳聚，得率为７．２％；曹健［８］曾用电解法从黑曲霉　菌丝体中提取壳聚糖，诏　了提取方法的可行Ｉ生；ＣＡＩ　Ｊ等　［９－蛔研究了酶法从黑曲霉菌丝体中酶法提取壳聚糖，并得　到了高质量的产品；骆昆［１１】运用稀碱破壁的方法，对青霉　素菌丝体的高值化利用进行了研究，并提出了可行性路　径；陈烟等［　２］运用碱法与微波结合的方法对菌丝体提取，　确定了工艺路线。然而酶法和电解法条件要求较高，不利　由于壳聚糖分子内存在大量的游离氨基，使其溶解性提　高，反应活性增强，在抗肿瘤、抗凝血、抗衰老等保健和治　疗中发挥着不可小觑的作用【ｌ＿２】。　葡萄糖酸钠（ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｃｏｎａｔｅ，ＳＧ）是一种无毒性、　无腐蚀性、无挥发性、具有咸苦昧的温和有机酸钠盐，目　前主要采用发酵法生产，酶法生产还未普及　。生物发酵　于工业化生产【Ｉ３］。近年来，壳聚糖作为活性多糖，越来越受　广大科研工作者的关注。黑曲霉菌丝体中甲壳素含量高，　在发酵行业剩余量大，即可以降低壳聚糖的生产成本，又　能增加企业产值，实现资源高值化利用。本研究以葡萄糖　酸钠发酵废弃黑曲霉菌丝体为原料，以酸碱法提取壳聚糖　的方法为基础，选取热碱法提取壳聚糖㈣，并对工艺条件　进行了改进和优化，为后续葡萄糖酸钠的清洁生产提供了　法生产葡萄糖酸钠是以黑曲霉为发酵菌种，葡萄糖为原　料，通过深层通风发酵生产，生产过程中会产生大量的黑　曲霉废弃菌丝体，传统的处理方式都是焚烧或者掩埋，不　仅造成了资源的浪费，还污染了环境　－６］。黑曲霉（Ａｓ．　ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）菌丝体细胞壁中含有２０％￣２２％的甲壳素，　是一种充足而廉价的壳聚糖提取材料。　收稿日期：２０１６－０９．２０　基金项目：国家高技术研究发展计划‘８６３计划’（２０１５ＡＡ０２１００３）　作者简介：孙永巧（１９８９一），女，硕士研究生，研究方向为微生物资源开发与利用。　通讯作者：刘建军（１９６２一），男，教授，博士，研究方向为工业微生物。　经验交流　中　国　酿　造　２们６　３５　期．１５９＂总第　２９８　期　可行性理论依据【　。　１材料与方法　１．１材料与试剂　Ｘ：—（Ｖ￣－Ｖ２）ｘｃｘ０．０１４　０×Ｆ×１００　ｍｘＷ１００　式中：　一试样中蛋白质的含量，％；　一试样中消耗盐酸或　硫酸标准滴定样的体积，ｍＬ；ｖ＿厂试剂空白消耗硫酸　或盐酸标准滴定样的体积，ｍＬ；　一吸收消化液的体　１．１．１样品来源　产葡萄糖酸钠发酵后黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）菌丝　体：兖州百盛生物科技有限公司。　１．１－２试剂　氢氧化钠（分析纯）：北京益利精细化学品有限公司；　浓盐酸、浓硫酸（均为分析纯）：莱阳经济开发区精细化工　厂；醋酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖　（优级纯）：西宝生物科技（上海）有限公司。　１．２仪器与设备　Ｌ５３０多管架自动平衡离心机：湖南湘仪实验室仪器　开发公司；ＵｌｔｉＭａｔｅ　３０００高效液相色谱系统：戴安（中国）　有限公司；７２２可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限　公司；ＤＨＧ．９１４０型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设　备有限公司；ＬＤＺＸ．７５ＫＢＳ立式压力蒸汽灭菌器：上海申　安医疗器械厂。　１．３方法　１．３．１壳聚糖提取工艺流程　菌体预处理冷冻干燥一粉碎过筛（４０目）一称取一定量的菌　体（２０．００　ｇ）一加入６００　ｍＬ　６％ＮａＯＨ在９５　ｃ【＝条件下冷凝回流２　ｈ　（脱蛋白）一离心清洗至中性一加入１００　ｍＬ　３０％ＮａＯＨ在１２０　ｏＣ　条件下处理ｌｈ　去乙酰基）一离【　水清洗至中性一再加入１００　ｍＬ　３０％ＮａＯＨ在１２０　ｏＣ条件下反应ｌ　ｈ（浓碱重复脱乙酰处理方式）一　离心水洗至中性一１２％醋酸９５℃条件下提取２　ｈ一离心取上　清液备用，残渣重复提取一次一离心得到两份上清提取液备　用一用２０％ＮａＯＨ滴定至上清液出现白色絮状沉淀（ｐＨ在１３．０左　右）一离心水洗沉淀至中性一７０℃烘干得壳聚糖成品　１．３．２菌丝体预处理【　２］　经板框过滤后的菌丝体，水分含量为５０．７５％，用去离　子水（固液比为１：２０（ｇ：ｍＬ））浸泡至分散均匀，挑出明显可　见杂质，抽滤去除水分，再用蒸馏水冲洗滤饼至滤出液固　形物含量１％以下；真空冷冻干燥清洗处理的菌丝体，用粉　碎机粉碎，过４０目筛，得到颗粒均匀的菌丝体。　１．３－３分析检测　菌体蛋白测定采用凯氏定氮’法【　３】：参照ＧＢ／Ｔ　２００９５—　２０１０（（食品中蛋白的测定》。具体步骤如下：精确称取样品　０．２５０　ｇ，移入２５０　ｍＬ氮瓶中，加入催化剂后在通风厨里进　行消化，炭化后进行定容待测；取测定样品体积为１０　ｍＬ，　４０　ｇ／Ｌ氢氧化钠１０　ｍＬ，以甲基红．溴甲酚绿（１：５，Ｖ／Ｖ）作为　指示剂，硼酸吸收液取２０　ｍＬ，吸收分解的氨气；用０．１　ｍｏｌ／Ｌ　的盐酸标准液进行滴定，计算出总氮量，换算成蛋白质的　含量。菌体蛋白含量及蛋白去除率（ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ，Ｒａ）的计　算公式如下：　积，ｍＬ；ｒ硫酸或盐酸标准滴定液浓度，ｍｏＦＬ；　０．０１４Ｏ一１．０　ｍＬ硫酸［ｃ（１／２Ｈ２Ｓｏ４）＝１．０００　ｍｏ￣＿Ｊ或盐　酸［ｃ（ＨＣ１）＝１．０００　ｍｏｌ／Ｌ］标准滴定溶液饵当的氮的质　量，ｇ）；ｎｒ试样的质量，ｇ；Ｆ－氮换算为蛋白质的系　数，６．２５。　警×１００％　式中：Ｒ　蛋白质去除率，％；　一预处理后菌体蛋白质含　量，％；　一菌丝体脱蛋白处理后样品中蛋白质含　量，％。　菌体多糖的测定采用苯酚．硫酸法【　司：测定方法参　照国标ＧＢ／Ｔ　１５６７２－－２００９《食用菌中总糖含量》的测定。　考虑到发酵后菌丝体都比较老化，酸解的浓度提高到　２．５ｍｏｌ／Ｌ。　甲壳素脱乙酰度测定采用酸碱滴定法旧：准确称取　０．２０００￣０．３０００　ｇ壳聚糖样品，加入２５０　ｍＬ锥形瓶中，再精　确加入０．１　ｍｏｌ／Ｌ标准盐酸溶液３０　ｍＬ，在２Ｏ℃条件下搅　拌至样品完全溶解，加入６滴甲基橙．苯胺蓝指示剂。以　０．１　ｍｏｌ／Ｌ标准氢氧化钠溶液滴定，读取所消耗氢氧化钠的　体积数值，壳聚糖脱乙酰度及得率计算公式如下：　一４２×（ｃ１　篙　．Ｃ，　）．１　０Ｏ０Ｍ（１．Ｗ）　×１００％　式中：Ｄ一样品脱乙酰度，％；２０３一甲壳素分子质量；Ｃｌ一盐　酸标准溶液浓度，ｍｏｌ／Ｌ：Ｖｌ一加入盐酸标准溶液的体　积，ｍＬ；Ｃｌ厂氢氧化钠标准溶液浓度，ｍｏＵＬ；ｖ＿厂消耗　氢氧化钠标准溶液体积，ｍＬ；Ｍ一样品质量，ｇ；ｗ一样　品水分含量，％；４２一乙酰基分子质量。　ＡＩ－　Ａ２　１００％　式中：ｙ为壳聚糖得率，％；Ｘ为称量瓶与壳聚糖成品的质量　之和，ｇ；Ｘ２为称量瓶烘干恒质量后的质量，ｇ：２Ｏ．ｏ０为　菌丝体总质量，ｇ。　壳聚糖样品的鉴定采用高效液相色谱法。样品处理：　分别取４ｇ壳聚糖样品和标准品加入到锥形瓶中，加入　６　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣ１　５０　ｍＬ，在１２１　ｏＣ，０．１　ＭＰａ条件下处理３０　ｍｉｎ，　然后用ＣａＣＯ，中和，定容至２５０　ｍＬ，水解成单体氨基葡萄糖　盐酸盐在高效液相色谱条件下进行分析。其色谱条件：　Ｃａｒｂｏｍｉｘ　Ｃａ—ＮＰ５色谱柱（７．８　ｍｍｘ３００　ｍｍ，５　ｍ），以纯　水为流动相，流速为０．８　ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为８０℃，进样量　为２Ｏ　Ｌ，保留时间为２５　ｍｉｎ。　１．３．４碱法提取壳聚糖的条件优化　黑曲霉菌丝体脱蛋白处理是提取壳聚糖的第一步。　・１　６０・加１６Ｖｏ‘　ｓ酬ａＩＣｈｉｎａ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅｓ　实验测定发现，菌体中蛋白含量不低，蛋白质在高温碱性　条件下会与多糖发生美拉德反应，影响多糖的提取与后　续纯化。在单因素试验的基础上，确定了影响蛋白质去除　的４个主要因素，即碱浓度、反应时间、反应温度、料液比。　以这四个明显影响条件作４因素３水平Ｌ。（３４）的正交设计　优化试验，以蛋白去除率（Ｒａ）为考察指标，正交试验因素　与水平见表１。　进行脱蛋白处理［　。　２．２碱法脱蛋白工艺的研究　由于碱法除蛋白效果比酸处理的效果好【旧，又能起到　破壁的作用，并且清洗后即使残留微量碱性，又对后续产　物脱乙酰处理没有影响　，故选碱法脱蛋白。在单因素试　验的基础上，确定了影响蛋白质去除的４个主要因素，即碱　浓度、反应时间、反应温度、料液比，以蛋白去除率为考察　表１　碱法提取条件优化正交试验因素与水平　Ｔａｂｌｅ　１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｏａｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ　１．３．５甲壳素脱乙酰基优化试验　本试验选取了ＮａＯＨ浓度为２０％、２５％、３０％、３５％、ｌ　　４０％，处理温度为８０℃、９０℃、１００℃、１ｌ０℃、１２０℃，碱处　理时间为１　ｈ、２　ｈ、３　ｈ、４　ｈ、５　ｈ，碱处理次数分别为１次、２次　进行探究。　４　４　４　６　６　６　８　８　８　４　４　９　Ｌ　１．３．６醋酸后处理　经过高温热碱提取的壳聚糖，由于脱乙酰度大小不　一，需要进一步纯化分离。根据壳聚糖能溶于稀酸中的性　质，用醋酸对其做进一步的提纯处理，得到一定脱乙酰度　范围的壳聚糖。　２结果与分析　２．１菌体预处理及成分分析　葡萄糖酸钠发酵结束后，菌丝体还残留发酵液及可溶　性盐离子，为了得到较为纯净的菌体，需先对其预处理『１５】。　菌丝体预处理前后各成分含量对比结果具体见表２。　表２菌体预处理前后主要组分含量比较　Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｎ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｆｕｎｇｕｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ　由表２可知，菌丝体预处理前后，灰分含量相差较大，　则可推断菌丝体清洗过程中洗去了大部分的附着葡萄糖　酸钠及发酵液中其他残留盐分，后续实验所需菌丝体都　以此标准处理。由于菌体经过水洗处理前经过反复冻融　处理，对细胞壁有一定的破坏作用，导致内容物溶出，蛋　白含量降低，多糖含量相应增高。处理后样品蛋白质含量　仍占很大比例，为提高后续提取壳聚糖的纯度，需对样品　指标，正交试验结果与分析见表３。　表３碱法提取条件优化正交试验结果与分析　Ｔａｂｌｅ　３　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｏ￣ｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ　试验号　贩应时ｃ　Ｎ／ｈ　ｌ　１：２５　１：３０　ｌ：３５　１　１：３５　３　４　５　６　７　８　９　ｌ：２５　１：３０　１　ｌ：３０　∞　如＂　１：３５　１：２５　７５．６３０　７５．７４３　７５．７１Ｏ　７５．７６０　ｋ　７５．４７７　７５．５１３　极差Ｒ　０．２３３　０．２３０　７　７　７（　由表３可知，各单因素条件对去除蛋白质的影响程度　３　７　７，铆　　由大Ｎｄ，依次为Ａ＞Ｃ＞Ｂ＞Ｄ，即碱浓度＞反应温度＞反　应时间＞料液比，碱法提取壳聚糖的最佳提取条件组合　为Ａ２９２Ｃ３Ｄ２，即Ｎａ０Ｈ浓度为６％，反应时问２　ｈ，反应温度为　９５℃，料液比为１：３０（ｇ：ｍＬ）。以此工艺条件进行验证，所得　蛋白质去除率达到了７７．加　２６％。　２．３甲壳素脱乙酰基优化实验　２．３．１碱浓度的选择　选择脱蛋白处理后的样品，处理温度为１００　ｏＣ，处理　时间为３　ｈ，碱浓度范围在２０％￣４０％，探究不同碱浓度对　甲壳素脱乙酰度的影响，结果见图１。　由图１可知，随着氢氧化钠浓度的增大，脱乙酰度上　升，但碱液浓度不能无限制提高，其原因是碱液浓度提　高，大分子链降解作用加剧，其次碱液浓度提高，反应成本　随之增加，故氢氧化钠浓度不宜过大，取３０％为宜；从壳聚　糖得率曲线趋势看出，随着碱浓度的加大，壳聚糖的产量　逐渐降低。兼顾两者的基础上，可选择３０％ＮａＯＨ作为脱乙　酰的处理浓度，此条件下的壳聚糖脱乙酰度为６１．６１％，得　率为１０．９８％。　２　经验交流　中　国　酿　造　２们６　３５　期・１６１翟　碱浓度／％　图１　碱浓度对甲壳素脱乙酰度的影响　Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｌｋａｌｉ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｃｈｉｔｉｎ　２－３－２处理温度的选择　选取脱蛋白处理后的样品，碱处理浓度为３０％，处理　时间为３　ｈ，处理温度为８０～１２０　ｏＣ，探究不同处理温度对　甲壳素脱乙酰度的影响，结果见图２。　巅　銎　处理温度／℃　图２处理温度对甲壳素脱乙酰基的影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｃｈｉｔｉｎ　由图２可知，在碱浓度一定条件下，随之温度的升高，　样品处理后脱乙酰度明显增高，说明处理的温度越高，对　甲壳素的脱乙酰作用越明显，因此在脱乙酰处理过程中，　温度是影响脱乙酰化反应的重要因素。由于过高的碱处　理温度，容易使多糖焦化，降解成低聚壳聚糖，影响其大　分子活性及外观质量，不应采用过高的温度［１９－２ｏ］。由壳聚糖　得率曲线可看出相同碱浓度处理下，壳聚糖的得率也相　差不大，故选择处理温度为１２０　ｏＣ，此温度提取条件下，壳　聚糖的脱乙酰度为７２．０２％，得率为ｌ０．３５％。　２．３－３碱处理时间的选择　称取一定量的脱蛋白处理样品，选取碱处理温度　１２０℃，氢氧化钠浓度为３０％，处理时间为１～５　ｈ，探究不　同处理时间对甲壳素脱乙酰反应的影响，结果见图３。　由图３可知，在甲壳素脱乙酰基过程中，随着碱处理　时间的延长，甲壳素的脱乙酰度逐渐升高，试验处理前２　ｈ时，　总第　２９８　期　・　脱乙酰化反应比较明显，２　ｈ过后，脱乙酰反应逐渐趋于　平缓，再延长处理时间对脱乙酰基反应效果不是太理想，　故选择碱处理时间为２　ｈ，此条件下脱乙酸度为５８．２１％。　处理时间／ｌｌ　图３碱处理时间对甲壳素脱乙酰的影响　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｆｏ　ａｌｋａｌｉ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｍｅ　ｏｆ　ｃｈｉｔｉｎ　２－３．４碱处理方式的选择　选取脱蛋白处理后的样品，处理温度为１２０℃，氢氧　化钠浓度为３０％，分两次对样品进行重复处理，各处理　１　ｈ，分别测定处理后样品的脱乙酰度，结果见图４。　８Ｏ　／　）　●　　ｌ７０　６０　《５　　５０　４Ｏ　基３０　２０　ｌ０　　＿由图４可知，两次重复碱处理方法能把第一次碱处理　甲壳素脱下来的乙酸钠及时脱离去，避免了碱液中乙酸钠　浓度过大而吸附在甲壳素表面，阻止反应进一步进行　。　结合图３、图４结果显示，重复碱处理方式对甲壳素的脱乙　酰化处理效果明显，得到的产品脱乙酰度明显提高，可达　到７８．８５％。　２．４醋酸后处理　将采用重复碱处理方式提取得来的壳聚糖粗制品溶　于１２％醋酸（ＨＡｃ）溶液中，９５℃冷凝回流２　ｈ，使其均匀的　溶解在醋酸溶液中，沉淀再用１２％醋酸重复处理一次，两　次处理上清液合并。然后用２０％ＮａＯＨ调节ｐＨ至１　３．０左右，　使壳聚糖再次析出，离心除去杂质，去离子水洗至中性，得　到纯度更高的壳聚糖，脱乙酰度能达到８４．４９％，得率为　９．５６％。　・３５　Ｎｏ’２　１　６２・加１６Ｖｏ　．．Ｃｈｉｎａ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅｓ　ｓｅ　Ｎ０．２９８２．５壳聚糖产品的鉴定　菌丝体经过脱蛋白、脱乙酰基处理、醋酸纯化后的样　品按照１．３．３样品处理水解方法及条件，对壳聚糖标准品和　过程中采用了分段式脱乙酰的处理方式，不能进行连续　性的正交优化处理，故还需要对甲壳素脱乙酰化反应进　一步优化探究。黑曲霉菌丝体作为葡萄糖酸钠工业发酵　提取样品水解样进行高效液相色谱分析，结果见图５。　产生的副产物，本实验的提取工艺为其后续清洁生产提　供了新的思考方向。　参考文献：　［１］郭鸣鸣．壳聚糖在几种食品抗菌包装中的应用研究［Ｄ】．无锡：江南大　６０．Ｏ　Ｂ　７　Ｔ２７　３７・５　｛２５　ｏ　１２．５　Ｏ　．　ｌＯ　ｏ　０．０　４．０　８．０　１２　０　１６　０　２０．０　２５．０　时ｆ￣Ｊ／ｍｉｎ　图５壳聚糖标准品（Ａ）与样品（Ｂ）的ＨＰＬＣ色谱图　Ｆｉｇ．５　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ（Ｂ）　，　由图５可知，其水解产物与壳聚糖标准品基本拟合；　无其他特征峰出现，则可以推断成品中并没有葡萄糖、甘　露糖、果糖等成分及聚合体【２１］；壳聚糖标准品水解后为氨　基葡萄糖盐酸盐，保留时间为７．７５８　ｍｉｎ；样品保留时问为　７．７２７　ｍｉｎ，二者保留时间基本一致，则可断定提取物的水　解产物为氨基葡萄糖盐酸盐，从而推断提取物为壳聚糖。　３结论　本实验探究出了从黑曲霉菌丝体中提取壳聚糖的可　行性实验工艺条件，并对实验工艺进行了优化，得出了提　取壳聚糖的最佳优化条件：料液比为１：３０（ｇ：ｍＬ），６％ＮａＯＨ　处理２　ｈ，反应温度９５℃时，菌体蛋白除去率达到７７．２６％；　浓碱浓度控制在３０％，处理温度为１２０　ｏＣ，重复分步处理　１　ｈ，得到壳聚糖的脱乙酰度为７８．８５％，得率为１０．５３％；后　续用ｌ２％ＨＡｃ纯化处理，得到了脱乙酰度为８４．４９％的壳　聚糖，得率为９．５６％。另外，对最终提取成品通过高效液相　色谱进行了验证，证明提取物为壳聚糖。　本研究采用浓碱重复脱乙酰处理的方式，大大缩短　了原本工艺的反应时间，节约了成本，为后续壳聚糖的提　取和纯化提供了理论支撑和数据参考。另外，壳聚糖提取　学，２０１５．　［２］刘　燕．壳聚糖及其衍生物在生物医药领域的应用研究进展【Ｊ］．化工　技术与开发，２００７，３６（１）：２６—２９．　［３］陈芬．发酵法生产葡萄糖酸钠工艺的优化［Ｊ］＿武汉纺织大学学报，　２０１３，２０（６）：２７．３１．　【４］王道会，武玉民，张云鹏，等．葡萄糖酸钠酶法生产工艺研究［Ｊ］ｌ中国　酿造，２０１５，３４（９）：３４—３６．　［５］王廷璞，王静，孟宪法，等．黑曲霉菌体制备壳聚糖的工艺研究［Ｊ］　ｌ中国酿造，２０１０，２８（８）：６２—６４．　［６】ＹＩ　Ｌ　Ｌ，ＪＩＡＯ　Ｗ　Ｔ，ＣＨＥＮ　Ｘ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ｒｅｃｌａｉｍｅｄ　ｗａｔｅｒ　ｒｅｕｓｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｓｃｉ，２０１　１，２３（１Ｏ）：１５８５－１５９３．　［７］陈雪梅．从柠檬酸厂废黑曲霉菌丝体中提取壳聚糖的工艺研究［Ｊ］．化　学与生物工程，２００５，２１（８）：４３—４５．　【８］曹健．黑曲霉电解法制备甲壳素的研究【Ｊ］．食品科学，２００６，２７（２）：　ｌ８６一ｌ８９．　［９］ＣＡＩ　Ｊ，ＹＡＮＧ　Ｊ　Ｈ，ＤＵ　Ｙ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｗａｓｔｅ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｏｆｃｉｔｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｐｌａｎｔ　［Ｊ］．Ｃａｒｂｏｈｙｄ　Ｖｏｌｙｍ，２００６，６４（２）：ｌ５１－１５７．　［１Ｏ］汪多仁．生物壳聚糖的开发与应用进展［Ｊ】．上海毛麻科技，２０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