血液及骨髓微生物学检验标准操作规程

血液及骨髓微生物学检验标准操作规程

1 检验目的

培养分离出临床患者的血液及骨髓中致病微生物并鉴定。为临床诊断提供病原学依据。

2 检验原理

根据微生物的生长的特点，在体外给微生物提供适宜的温度、湿度、营养等条件。通过培养得到微生物，再通过仪器的生化试验或血清免疫等方法鉴定出致病菌。

3样品采集及运送

3.1样品类型：血液及骨髓 3.2标本采集

3.2.1采集指征

可以感染患者出现以下一种或几种特征时，可以考虑采集血培养：发热≥38℃，低温≤36℃。寒战，白细胞增多（计数>10.0×10/L，特别是有核左移时）或减少（计数<3.0×10/L）皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白、降钙素、1，3-β-D葡聚糖升高及突发急性呼吸、体温和生命体征改变。 3.2.2采血时间

在患者接受抗生素治疗之前，患者寒战或者发热初期采血。超过发热峰值后，病原菌会逐渐被机体免疫系统清除，从而降低检出率。如果同其他项目一起，先采血培养。特殊情况见“9常规情况处理” 3.2.3采血部位

采集外周静脉血，不建议采用动脉血或者通过血管内导管采血。只有怀疑导管相关性血流感染时，可分别通过导管和外周静脉血采取相同量的血标本。多次血培养阴性，仍发热不退或全身感染症状明显但不能明确感染来源时，可考虑采集骨髓标本。 3.2.4消毒

首先采用75%酒精消毒穿刺部位皮肤，待干30秒以上，用安尔碘由内向外画圆消毒，直径3cm以上。待干后，可进行静脉穿刺采血。对碘过敏者可用75%酒精消毒60秒，待酒精挥发干燥后采血。血培养瓶口用75%乙醇消毒干燥60秒。

3.2.5采血量、采血瓶、采集套数

年龄 成人 采血量 每瓶采血量8-10ml 采血瓶 一套包括需氧瓶厌氧瓶各一个。用了抗生素，应使用树脂或活性炭的培养瓶 建议采集套数 至少从2个部位分2次采集 (即2套)以提高阳性率。同时可以帮助排除污染的可能。 9

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新生儿及1岁以下体重低于4kg的儿童 1-6岁儿童 一次抽血0.5-1.5ml 儿童瓶 1个部位1个瓶 每增加1岁增加1ml采血量 儿童瓶 2个部位，每个部位1个瓶 1-6岁儿童对于体重15-40kg 每个部位采集5-10ml 儿童瓶 2个部位，每个部位1个瓶 注：对感染性心内膜炎和真菌败血症应多次采集。

3.2.6用无菌注射器穿刺取血后勿换针头，直接注入血培养瓶并颠倒混匀防凝固，不可使用抗凝血。 3.2.7收集了血液标本的血培养瓶应立即送实验室，室温放置不要超过2小时。不可放冰箱储存。

4 试剂及仪器

4.1革兰染液、氧化酶试剂、触酶试剂、血琼脂平板、巧克力平板、麦康凯平板等。 4.2 BACT/ALERT 3D和BACTEC9120系统及血培养瓶。VITEK2 系统及相应的鉴定卡和药敏卡。 4.3接种环、电热烧灼器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱。

5 操作步骤

5.1收到标本后，立即对标本进行核收、编号、登记。门诊病人要登记联系电话。 5.2仪器自动化培养操作步骤详见《VITEK2标准操作规程》《BACT ALERT3D标准操作规程》

6 致病菌检验流程

有杂菌 一级报告 判断细菌种类 需氧培养 血液、骨髓 自动培养仪培养5天 厌氧培养 血培养仪报警，卸载瓶、吸取培养物 涂片、革兰染色 联系临床是否直接药敏 需氧瓶：转种血平板、麦康凯、巧克力平板、科玛嘉真菌平板35℃培养18-24h 厌氧瓶：转种血平板和厌氧血平板35℃培养18-24h。（厌氧血平板放入厌氧袋中） 有单个菌落，观察菌落特征并涂片染色

传代分纯 仪器或手工细菌鉴定及药敏试验 二级报告（最终报告）

7 结果报告

7.1一级报告

阳性报警血培养瓶卸载后，应立即进行涂片革兰染色。如未找到微生物应将培养瓶放回仪器继续培养。如果镜下找到微生物，应立即联系临床医生，报告内容包括：患者姓名、ID号、报阳时间、涂片革兰染色特征及形态。同时询问患者目前感染情况和抗生素使用情况，提出治疗建议。联系后要填写《危急值登记表》，记录报告时间、接收者、报告者。根据临床需求决定是否进行直接药敏试验。此试验结果不准确，适用危机情况。

7.2二级报告（最终报告）

培养瓶吸出物培养出的微生物需要进行仪器或手工的鉴定和药敏试验。最终报告菌种名称和标准药敏试验结果。如果怀疑是污染菌，要联系临床，并在报告单中提示“可能为污染菌或共生菌，建议复查”。

7.3阴性报告

正常人的血液是无菌体液

成年人两个瓶子报告：血培养5天无需氧菌、兼性厌氧菌、专性厌氧菌及真菌生长。 儿童一个瓶报告：血培养5天无无需氧菌、兼性厌氧菌及真菌生长。

8 血培养污染

即使进行严格的皮肤消毒以及在接种、传代中严格无菌操作，仍有3-5%的血培养结果来自皮肤（如表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、梭菌、白喉棒状杆菌等）或周围环境菌（如不动杆菌属、芽孢杆菌属）的污染菌株。然而，这些微生物有时也会成为致病菌甚至导致心内膜炎。在下列情况可能是致病菌： （1） 不同部位血液标本的培养瓶中培养出同一种微生物。 （2） 生长迅速，48h内。

（3） 多次分离出具有同样生物学特性和相同药敏结果的菌株。

所有的结果都应向临床医生报告，包括可能的污染菌，但不做药敏，在报告单上应有恰当的提示。 血培养发现两种或两种以上细菌生长，可能是复数菌菌血症，常见于衰弱的患者，也可能是污染菌。发生厌氧菌菌血症时可能有多种病原菌感染，如肠道的严重创伤或手术，可能发生严重的爆发性菌血症。

9 常见情况处理

9.1导管相关血流感染

9.1.1对于短期外周导管的建议

采集2套外周静脉血培养。无菌操作拔除导管，采用Maki半定量法进行培养，导管尖端片段长度5cm。培养解释如下表

培养结果 ≥1套血培养阳性，导管培养阳性（半定量≥15个菌落），两种培养菌种相同 ≥1套血培养阳性，导管培养阴性 解释 提示血流感染（CRBSI） 无法判断，但是如果分离菌株是金黄色葡萄球菌或白色假丝酵母，并没有其他明确感染源，仍然提示CRBSI 2套血培养阴性，但导管片段培养阳性 2套血培养和导管均阴性 提示导管定植 不可能是CRBSI 9.1.2对于保留导管的患者，血培养结果解释建议如下 培养结果 静脉和导管2套血培养得到的菌株其鉴定结果和药敏谱均相同，并没有其他明确感染 2套血培养均阳性并分离菌种相同，导管血阳性报警时间比外周血早120min以上没有其他明确感染源 2套血培养均阳性并分离菌种相同，导管血阳性报警时间比外周血早的时间不足120min，但是2套血培养获得鉴定和药敏谱相同的分离株 2套血培养阳性，导管血菌量为外周血中菌量5倍以上，没有其它明确感染源。 仅仅是导管血培养阳性 提示CRBSI，此方法要求手工定量血培养系统，如裂解离心法。（暂时没开设） 不能判断为CRBSI，提示导管有细菌定植或者采血过程有污染。 仅仅是外周血培养阳性 不能确定为CRBSI，但是如果分离到的是金黄色葡萄球菌或念珠菌属，并且没有其他明确的感染源，也可能为CRBSI。如果要确定是否为CRBSI需要进行导管片段半定量培养，分离到相同菌株，并且没有其他明确感染源。 9.1.3决定拔除导管的患者 培养结果 1套以上血培养和导管片段培养阳性，并且菌种鉴定解释 可能为CRBSI 提示CRBSI 提示CRBSI 解释 提示CRBSI

和药敏谱相同 1套以上血培养阳性且导管片段培养阴性，若血培养阳性菌株为金黄色葡萄球菌或念珠菌。 以上情况如果要进行确认，要求进一步采集其他外周血培养，获得同一菌株，没有其他明确感染源 血培养阴性，导管片段培养阳性 提示定植，不是CRBSI 为CRBSI 则可能为CRBSI 9.2感染性心内膜炎

9.2.1急性心内膜炎

应立即采集血培养以避免延误治疗。建议在经验用药前30min内做2-3套。 9.2.2亚急性心内膜炎

建议每隔0.5-1小时采集血培养1套，进行3套血培养。

9.3苛养菌处理

如果常规血培养72小时阴性而病人症状提示感染性心内膜炎，应提高培养基的营养或者补加添加剂。有利于培养要求苛刻生长缓慢的微生物，如人内心杆菌、艾肯菌、金氏菌、放线菌等。适当延长培养时间。

10 血培养质量控制

10.1分析前

10.1.1评估患者是否符合采血指征。

10.1.2标本采集严格执行血培养标本采集程序，避免污染。定期统计血培养污染率，及时与临床沟通并采取措施。

10.2分析中

培养系统的性能验证，革兰染液、鉴定试剂、培养基等各种试剂的质量控制。详见各项目SOP和设备SOP相关文件。

10.3分析后

实验室建立三级报告制度，定期汇总分析。对LIS系统进行传输验证。

11 标本保存

血培养阳性的瓶子室温保存5天，以备日后复核。

12 临床意义

引起全身性血流感染病原体较多，当免疫功能降低时，机体的正常菌群导致内源性感染是血流感染的

主要原因。存在人体外环境中的病原菌，也可以通过呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道、皮肤、植入性操作等途径入侵机体导致外源性感染。一旦病原生物入侵血流，在血液中繁殖，释放毒素和代谢产物，并诱导细胞因子释放，可引起寒战、高热、心动过速、呼吸急促、皮疹、肝脾肿大和精神神志改变。严重时休克、弥散性血管内凝血和多脏器功能衰竭。由于死亡率高，危害严重，临床医生对血流感染应做到快速、早期诊断。血培养是诊断血流感染的主要手段。

13 参考文献

序号 13.1 13.2 13.3

唯一性编号 ISBN978-7-5478-1226-6/R·395 ISBN978-7-5478-2179-4/R·717 文献名称 《临床微生物学诊断与图解》第三版 《血流感染实验诊断与临床诊治》第二版 ISBN978-7-117-19862-2/R·19863 《全国临床检验操作规程》第四版